抗菌抑菌實驗定義概念

用于測定抗菌藥物體外抑制細菌生長效能的實驗稱爲抑菌實驗。經(jīng)過抑菌實驗，可以測定一個藥物的最低抑菌濃度，用以評價該藥物的抑菌功能，這是抗菌藥物的最根本的藥效學數(shù)據(jù)。次要辦法有停止定性測定的分散法（如抑菌斑實驗）和停止定量測定的濃縮法（如最低抑菌濃度實驗）。

目錄

常用辦法、常量肉湯濃縮法、微量肉湯濃縮法、瓊脂濃縮法、紙片分散法、E實驗

常用辦法

常量肉湯濃縮法

抗菌藥物儲存液制備：抗菌藥物儲存液濃度不應低于1000μg/ml(如1280μg/ml)或10倍于最高測定濃度。溶解度低的抗菌藥物可稍低于上述濃度?？咕幬镩g接購自廠商或相關機構。所需抗菌藥物溶液量或粉劑量可公式停止計算。例如：需配制100 ml濃度爲1280μg/ml的抗生素儲存液，所用抗生素爲粉劑，其藥物的無效力爲750μg/mg。用剖析天平準確稱取抗生素粉劑的量爲182.6 mg。依據(jù)公式計算所需濃縮劑用量爲：（182.6 mg×750μg/ml）/1280μg/ml=107.0ml，然后將182.6 mg抗生素粉劑溶解于107.0ml濃縮劑中。制備抗菌藥物儲存液所用的溶劑和濃縮劑見表5。配制好的抗菌藥物儲存液應儲存于-60℃以下環(huán)境，保管期不超越6個月。

藥敏實驗用抗菌藥物濃度范圍 依據(jù)NCCLS抗菌藥物敏理性實驗操作規(guī)范，藥物濃度范圍應包括耐藥、中介和敏感分界點值，特殊狀況例外。

培育基：NCCLS引薦運用Mueller-Hinton（MH）肉湯，pH7.2~7.4。需氧菌及兼性厭氧菌在此培育基中生長良好。在測試葡萄球菌對苯唑西林的敏理性時，應在肉湯中參加2%（W/V）氯化鈉，按制造廠家的要求配制需求量的MH肉湯。嗜血桿菌屬菌運用HTM肉湯，肺炎鏈球菌和其它鏈球菌運用含2%~5%溶解馬血的MH肉湯。

接種物的制備：有2種辦法配制接種物，一是細菌生長辦法，用接種環(huán)挑取形狀類似待檢菌落3-5個，接種于4-5ml的水解酪蛋白（MH）肉湯中，35℃孵育2-6h。增菌后的對數(shù)生臨時菌液用生理鹽水或MH肉湯校正濃度至0.5麥氏比濁規(guī)范，約含1~2×108CFU/ml。二是間接菌落懸液配制法，對某些苛養(yǎng)菌，如流感嗜血桿菌、淋病奈瑟菌和鏈球菌及甲氧西林耐藥的葡萄球菌等菌株，引薦間接取培育18~24h的菌落分配成0.5麥氏比濁規(guī)范的菌懸液。用MH肉湯將上述菌懸液停止1∶100濃縮后備用。留意應在15分鐘內(nèi)接種完配制好的接種物，并取一份接種物在非選擇性瓊脂平板上傳代培育，以反省接種物純度。

注：在臨床微生物學檢驗中，麥氏比濁法常用于細菌鑒定、藥敏實驗前配置菌液時大致判別菌液濃度的一種辦法，通常以為，如將配菌液濃度配成0.5麥氏比濁管時，相當于1.5×108細菌數(shù)/ml，由于辦法自身就是一種估量的辦法，所以雖然不同細菌大小差別很大，除了真菌孢子，細菌的差異不大，后果不會有影響。但是，規(guī)范比濁管的濃度，是藥敏實驗后果的影響要素之一。

附：0.5麥氏比濁管配制辦法

0.048M BaCL2 (1.17% W/V BaCL2 . 2H2O) 0.5ml

0.36N H2SO4 (1%, V/V) 99.5ml

將二液混合，置螺筆試管中，放室溫暗處保管。用前混勻。

無效期爲6個月。

濃縮抗菌藥物的制備及菌液接種

濃縮抗菌藥物的制備及菌液接種 取無菌試管（13×100mm）13支，排成一排，除第1管參加1.6mlMH肉湯外，其他每管參加MH肉湯1ml，在第1管參加抗菌藥物原液（如1280μg/ml） 0.4ml混勻，然后汲取1ml至第2管，混勻后再汲取1ml至第3管，如此延續(xù)倍比濃縮至第11管，并從第11管中汲取1ml棄去，第12管爲不含藥物的生長對照。此時各管藥物濃度順次爲256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml。然后在每管內(nèi)參加上述制備好的接種物各1ml，使每管最終菌液濃度約爲5×105CFU/ml。第1管至第11管藥物濃度辨別爲128、64、32、16、8、4、2、1、05、0.25、0.125μg/ml。

孵育：將接種好的濃縮管塞好塞子，置35℃普通空氣孵箱中孵育16~20h；嗜血桿菌和鏈球菌在普通空氣孵箱中孵育20~24h；對能夠的耐甲氧西林葡萄球菌和耐萬古霉素腸球菌應繼續(xù)孵育滿24h。

結果判別與解釋：在讀取和報告所測試菌株的MIC前，應反省生長對看管的細菌生長狀況能否良好，同時還應反省接種物的傳代培育狀況以確定其能否凈化，質(zhì)控菌株的MIC值能否處于質(zhì)控范圍。以肉眼察看，藥物最低濃度管無細菌生長者，即爲受試菌的MIC。甲氧芐胺嘧啶或磺胺藥物的肉湯濃縮法起點判別，與陽性生長對看管比擬抑制80%細菌生長管藥物濃度爲受試菌MIC。

依據(jù)NCCLS引薦的分界點值規(guī)范，判別耐藥（resistant, R）、敏感(susceptible, S)或中介（intermediate, I）。S表示被測菌株所惹起的感染可以用該抗菌藥物的常用劑量醫(yī)治無效，忌諱癥除外。R指該菌不能被抗菌藥物的常用劑量在組織液內(nèi)或血液中所到達的濃度所抑制，或?qū)儆诰哂刑囟退帣C理（如β-內(nèi)酰胺酶），所以臨床醫(yī)治效果不佳。I是指MIC接近藥物的血液或組織液濃度，療效低于敏感菌。還表示被測菌株可以經(jīng)過進步劑量（如β-內(nèi)酰胺類藥物）被抑制，或在藥物生感性濃集的部位（如尿液）被抑制。另外，中介還作爲“緩沖域”，以避免由巨大的技術要素失控，所招致較大的錯曲解釋。

微量肉湯濃縮法

抗菌藥物和培育基制備 同常量肉湯濃縮法。

MIC板制備

板制備 無菌操作，將倍比濃縮后不同濃度的抗菌藥物溶液辨別加到滅菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第11孔加藥液，每孔10μl，第12孔不加藥作爲生長對照，冰凍枯燥后密封，-20℃以下保管備用。

接種物制備：將用生長法或間接菌懸液法制備的濃度相當于0.5麥氏比濁規(guī)范的菌懸液，經(jīng)MH肉湯1∶1000濃縮后，向每孔中加100μl，密封后置35℃普通空氣孵箱中，孵育16~20h判別后果。當實驗嗜血桿菌屬，鏈球菌屬時，孵育工夫爲20~24h，實驗葡萄球菌和腸球菌對苯唑西林和萬古霉素的藥敏實驗時孵育工夫必需滿24h。此時，第1孔至第11孔藥物濃度辨別爲128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/ml。

結果判別：以在小孔內(nèi)完全抑制細菌生長的最低藥物濃度爲MIC。當陽性對照孔（即不含抗生素）內(nèi)細菌分明生長實驗才有意義。當在微量肉湯濃縮法呈現(xiàn)單一的跳孔時，應記載抑制細菌生長的最高藥物濃度。如呈現(xiàn)多處跳孔，則不應報告后果，需反復實驗。通常對革蘭陰性桿菌而言，微量肉湯濃縮法測得的MIC與常量肉湯濃縮法測得的后果相反或低一個濃縮度（1孔或2倍）。

瓊脂濃縮法

引見

瓊脂濃縮法是將不同劑量的抗菌藥物，參加消融并冷至50℃左右的定量MH瓊脂中，制成含不同遞加濃度抗菌藥物的平板，接種受試菌，孵育后察看細菌生長狀況，以抑制細菌生長的瓊脂平板所含最低藥物濃度爲MIC。本法優(yōu)點是可在一個平板上同時作多株菌MIC測定，后果牢靠，易發(fā)現(xiàn)凈化菌；缺陷是制備含藥瓊脂平板費時費力。

培育基制備：運用MH瓊脂，按商品闡明書停止配制，pH7.2~7.4。淋病奈瑟菌運用GC瓊脂根底加1%添加劑；其它鏈球菌運用含5%（V/V）綿羊血的MH瓊脂（當實驗磺胺藥時，運用溶解的馬血）。

含藥瓊脂平板制備：依據(jù)實驗設計，將已倍比濃縮的不同濃度的抗菌藥物辨別參加已加熱溶解，并在45~50℃水浴中均衡的MH瓊脂中，充沛混勻傾倒滅菌平皿，瓊脂厚度3~4mm。通常按1∶9比例配制藥物瓊脂平板，依據(jù)需求來選擇藥物濃度范圍。配制好的含藥瓊脂平板應裝入密封塑料袋中，置2~8℃冰箱可儲存5天。

接種物制備與接種：制備濃度相當于0.5麥氏規(guī)范比濁管的菌懸液，再1∶10濃縮，以多點接種器汲取制備好菌液（約1~2μl）接種于瓊脂平板外表，每點菌數(shù)約爲104CFU，構成直徑爲5~8mm的菌斑。接種好后置35℃孵育16~20h（甲氧西林耐藥葡萄球菌、萬古霉素耐藥腸球菌孵育工夫應滿24h），察看后果。奈瑟菌屬、鏈球菌屬細菌置5%二氧化碳、幽門螺桿菌置微需氧環(huán)境中孵育。

結果判別：將平板置于暗色、無反光物體外表上判別實驗起點，以抑制細菌生長的最低藥物濃度爲MIC。在含甲氧芐胺嘧啶或磺胺瓊脂平板上可見細微細菌生長，與生長對照比擬抑制80%以上細菌生長的最低藥物濃度作爲起點濃度。

假如呈現(xiàn)有2個以上菌落生善于含藥濃度高于起點程度的瓊脂平板上，或低濃度藥物瓊脂平板上不長而高濃度藥物瓊脂平板上生長景象，則應反省培育物純度或反復實驗。

紙片分散法

紙片分散法(K-B法)又稱瓊脂分散法

K-B法藥敏實驗時接種物配制有兩種辦法。

第一種是肉湯增菌法（對數(shù)生長法），是用接環(huán)挑取3-5個細菌菌落入肉湯增菌管中停止增菌4-6小時，然后用生理鹽水或肉湯對增菌管中的培育物停止?jié)饪s校正使其濃度到達0.5麥氏比濁規(guī)范（由于經(jīng)過增菌培育其培育物濃度普通都高于此規(guī)范）。

第二種辦法是間接菌落法：從孵育18-24小時的非選擇性培育基上，挑取3-5菌落，間接用肉湯或鹽制成懸液作爲接種，然后將濁度調(diào)整至0.5麥氏比濁規(guī)范。此法是檢測苛養(yǎng)菌（如嗜血桿菌、淋病奈瑟菌和鏈球菌）和潛在的對甲氧西林耐藥的葡萄球菌的引薦辦法。

將菌制成菌懸液用無菌棉簽蘸取菌液在管壁上擠去多余菌液 ,涂布整個M2H平板外表 ,重復 3 次 ,每次將平板旋轉(zhuǎn)60 度 ,保證涂布平均 ,35 ℃培育后菌落呈半交融形態(tài) ,否則影響藥敏后果。

K-B 法指定用 M-H瓊脂平板 ,使用直徑90cm平皿 ,在程度的無菌臺上傾倒 ,精確量取高壓滅菌后的M2H瓊脂液25ml ,使之瓊脂板厚度爲 4mm。否則厚渡過高 ,使含藥物紙片的藥物半球形分散的體積加大 ,招致假耐藥;反之招致假敏感。

要求紙片直徑 6.00～6.35mm每片吸水量約012 μl ,紙片的藥物含量必需與 K 2B 法規(guī)則的

分歧 ,用前必需做質(zhì)量鑒定 ,質(zhì)量合格方可運用。紙片的保管尤爲重要 ,普通要求保管在有枯燥劑的容器內(nèi)高溫保管 ,紙片取出后須放室溫10min前方可翻開 ,否則空氣中的水份冷凝在紙片上易潮解 ,使藥物生效影響藥敏實驗后果。

E實驗

E實驗是指濃度梯度瓊脂分散實驗，其原理根本同分散法，即濃度呈延續(xù)梯度的抗菌藥物從塑料試條中向瓊脂中分散，在試條四周抑菌濃度范圍內(nèi)受試菌的生長被抑制，從而構成通明的抑菌圈。E實驗綜合了濃縮法和分散法的原理和特點，同時還補償了二者的一些缺乏，可以像濃縮法一樣間接定量測出抗菌藥物對受試菌的MIC。

培育基、菌液制備和接種

培育基、菌液制備和接種 同紙片分散法。

貼E實驗條：同紙片分散法，E實驗條的刻度面朝上，不得貼反，一旦接觸瓊脂后不得再挪動。直徑150mm的平皿內(nèi)可放置6根E實驗試條，90mm者普通只能放置1根。

孵育工夫和溫度：同紙片分散法。

結果閱讀：孵育后圍繞試條可構成一個橢圓形的抑菌圈，在抑菌圈和試條的橫切相交處試條上的讀數(shù)刻度即是測定抗菌藥物對受試菌的MIC。閱讀時應留意的成績見供給商的商品闡明書。